Гистопатологическая оценка стентов фильтра ретиноевой кислоты в модели подвздошной артерии кролика

Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE.24 и законодательство Европейского Союза25 Следуя принципу 3R (уменьшить, улучшить, заменить), чтобы обеспечить: сокращение количества используемых животных, улучшение экспериментальных методов и условий их жизни, чтобы свести к минимуму их боль или страдания. Эксперименты проводились в Фонде биомедицинских исследований Афинской академии, Греция/Афины. Протокол был одобрен Комитетом по оценке протокола Институтов биомедицинских исследований Афинской академии, Греция, и Управлением сельскохозяйственной и ветеринарной политики провинции Аттика, Греция, государственным органом. Все методы проводились в соответствии с соответствующими национальными и международными рекомендациями и правилами.

режим стента

Внутрисосудистые стенты были имплантированы в подвздошные артерии 30 самцам новозеландских кроликов (от 2,5 до 3,5 кг). Модель подвздошной артерии кролика была выбрана в качестве первого теста для доклинической оценки фильтрующих стентов РА, поскольку размер и реакция на повреждение подвздошных артерий кролика относительно сопоставимы с коронарными артериями человека.22,26. Животных содержали индивидуально в клетках из нержавеющей стали. Каждому кролику имплантировали два стента из той же группы, по одному стенту в каждую подвздошную артерию. Всего было использовано шестьдесят стентов, которые были разделены на десять групп, по шесть стентов в группе и по три животных в группе. Срок наблюдения после трансплантации составил 4 недели.

Процедура имплантации стента

Кроликов анестезировали внутримышечной инъекцией кетамина (35 мг/кг) и ксилазина (7 мг/кг) и контролировали с помощью интраоперационной периферической пульсоксиметрии. Мы использовали опубликованный метод чрескожного сосудистого доступа.27. Короче говоря, животных помещали в лежачее положение, иммобилизовали. Обе ушные раковины были выбриты и стерилизованы повидон-йодом. Младший стажер и опытный интервенционный кардиолог выполнили чресушной сосудистый доступ, плановую ангиопластику и имплантацию стента в подвздошную артерию.

для первоначальных имплантатов и для установления точного положения абатмента, а также для сбора данных, необходимых для параллельного исследования, направленного на разработку моделирования процесса дилатации in silico28 Постпроцедурная оптическая когерентная томография (ОКТ) была выполнена в небольшом количестве стентов (N = 4). Подготовка и материалы, используемые для операции, были немного модифицированы для тех случаев, когда проводилась ОКТ.

Центральную ушную артерию пунктировали венозным катетером 22 калибра примерно в дистальной половине ее подкожного пути. Затем удаляли центральную иглу катетера. Гидрофильный проводник диаметром 0,018 дюйма (V18, Boston Scientific, MA) осторожно вводили в наружную сонную артерию и нисходящую аорту/дугу аорты, а затем в грудную аорту. Катетер удаляли, делали 3-сантиметровый разрез дермы в месте первоначального прокола по ходу проводника до основания спины. В тех случаях, когда необходимо было выполнить ОКТ, тонкий, 0,035-дюймовый F-совместимый 0,035-дюймовый интродьюсер (Terumo, Токио, Япония) вставляли в наружную сонную артерию после пошаговых последовательных расширений с использованием специального экспандера интродьюсера. Перед введением интродьюсера по проводнику были сделаны повторные удлинения для удаления суженной периферической части артерии. Затем внутриартериально вводили гепарин (100 МЕ/кг). По прибытии проводниковый катетер 5F (Envoy MPC, Codman, США) продвигали к дистальному отделу аорты, чтобы получить прямое взаимодействие с целевыми сосудами, и выполняли ангиографию для визуальной оценки диаметра сосудов и в качестве дорожной карты для доступа к бедренным сосудам. После ангиографии проводник был заменен проводником диаметром 0,014 дюйма (Lotus 2, Roundes, Швейцария) и введен в бедренную артерию. Наконец, стент был направлен и установлен в нескольких миллиметрах от места отхождения подвздошной артерии (10 r, 20 с). После имплантации стента ОКТ проводили без контрастного вещества, а только с промыванием физиологическим раствором.

В тех случаях, когда OCT не был запланирован, процесс был точно таким же, как описано выше, вплоть до точки входа с использованием оболочки идентификатора. Для приобретения точки доступа использовался совместимый с 4-F 0,018-дюймовый корпус Radifocus Introducer II (Terumo, Токио, Япония), и следующие действия были такими же, как описано выше. Другая дифференциация была по проводниковому катетеру, где указанный выше катетер был заменен на ангиографический катетер 4-F (Impress VER-H, Merit Medical, США). Заключительную ангиографию выполняли для оценки положения стента, целостности кровеносных сосудов и наличия возможных осложнений (например, тромбообразования, наличия внутреннего лоскута, почти идеально развернутого стента и т. д.). Животные не получали никаких антитромбоцитарных препаратов.

тип стента

Для изготовления подложек для фармакологического крекинга голые металлические кобальт-хромовые стойки (Leader Plus, Roentes, Zug, Швейцария) размером 12 мм и длиной 2,50 мм были покрыты слоями, состоящими из смеси полимера и лекарственного средства (таблица 3). . Были использованы два различных типа полимеров: полимер «А», поли(молочно-гликолевая кислота) (PLGA) и полимер «В», молочная кислота (PLA). Использовали три разные дозы RA с полимерами «A» и «B», что привело к трем наборам стентов для каждого полимера: AL, AM и AH с «низкой», «средней» и «высокой» дозой соответственно и BL, BM, BH с полимером B, «низкая», «средняя» и «высокая» дозы соответственно. Поскольку ретиноевая кислота чувствительна к свету и кислороду, были предприняты меры для защиты препарата от порчи в процессе нанесения покрытия и хранения. Лекарство обрабатывали при тусклом желтом свете при приготовлении смесей для покрытия. После покрытия и приклеивания к катетерам стент-системы упаковывали в непрозрачные пакеты из алюминиевой фольги с поглотителями влаги и кислорода. Чтобы установить количество лекарственного средства на стентах, после производства были проведены тесты контроля качества. Два набора стентов, EF и EG, были изготовлены с одинаковой дозой эверолимуса с использованием полимеров А и В соответственно. Все окрашенные стойки обжимаются с помощью соединительных систем Rontis Leader Plus с размерами 2,5 x 12 (REF: LP20 / 12).

Таблица 3. Типы стентов, составы покрытий и дозы препаратов для тестируемых изделий.

Также использовались голые металлические (непокрытые) кобальт-хромовые стенты Rontis и коммерчески доступные сломанные стенты Everolimus (Xience Pro Everolimus Eluting Coronary Stent System, Abbot Vascular, Санта-Клара, США) того же размера (группа C и D соответственно). Типы стентов, составы покрытий и дозы лекарственных средств для тестируемых изделий включены в Таблицу 3.

Анатомия и гистология

Эвтаназию животных проводили инъекцией пентобарбитона натрия. Вскрытие производил опытный ветеринар. Обработанные срезы артерий собирали и сохраняли в 10% нейтральном забуференном формалине и передавали для гистологической обработки, анализа изображений и гистологической оценки. Гистологию и морфометрию выполняли в независимой лаборатории, сертифицированной по GLP (Anapath Services, GmbH, Швейцария), сертифицированным ветеринарным патологоанатомом. Образцы, взятые из мест имплантации, обрабатывали путем заливки метилметакрилатной (ММА) смолы, распиливали алмазной ленточной пилой в поперечном направлении образца (система ЭКЗАКТ), фрезеровали и полировали до конечной толщины примерно 40–60 мкм (система ЭКЗАКТ). ). Один срез каждого образца окрашивали модифицированным красителем Paragon в соответствии со стандартными операционными процедурами. Была проведена оценка предметных стекол для проверки качества, а затем предметные стекла были переданы патологу-исследователю для оценки патологии.

Параметры оценки

Параметры, оцениваемые гистопатологическим исследованием, которые были адаптированы к системе оценки, описанной в ISO 10993-6:2016, включали: артериальное взаимодействие [endothelial loss (%), surface (fibrin/platelet thrombus), intima proliferation, smooth muscle in intima proliferation, proteoglycan/collagen]Артериит (эндотелий/медиа, адвентиция), потеря медиальных гладкомышечных клеток (ГМК) [Medial SMC loss (transmural), Medial SMC loss (circumference)], ткани замещения артериальных клеток (протеогликаны, коллаген, адвентиция), реакция хозяина, связанная с трансплантацией (плеоморфные клетки, лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, гигантские клетки, некроз, фиброз, чрескожное кровоизлияние/накопление фибрина, неоваскуляризация, жировые инфильтраты, разрыв эластичной пластинки (EL) (наружный разрыв EL, внутренний разрыв EL), медиальная гипертрофия (очаговая, диффузная). Была применена модифицированная система оценки, описанная в ISO 10993-6: 2016. Каждый параметр оценивался от 0 до 4 в зависимости от результатов гистологического исследования. В соответствии со стандартом ISO 10993-6:2016 разница в баллах составляет от 0,0 до 2,9: отсутствие реакции или незначительная реакция хозяина, 3,0–8,9 — легкая реакция хозяина, 9,0–15,0 — умеренная реакция хозяина и ≥ 15,1 — сильная реакция хозяина по сравнению с эталонными материалами.

Для сканирования образцов артерий использовали сканер слайдов Olympus Slideview VS200 с камерой Olympus U-TV1XC и объективом 20×. Количественную оценку проводили с использованием программного обеспечения Olympus для визуализации и анализа изображений CellSens v1.18.

Количественную оценку проводили путем анализа изображений каждой артерии, включая следующие параметры: EEL, мкм2), область внутри внутренней эластичной пластинки (IEL; мкм2), люмен (мкм2), одеяло (микрон.)2) (расчет: IEL-люмен), среда (мкм2) (расчет: EEL – IEL), стеноз (%) [calculation:100 − (100 × Lumen/IEL)], внутренняя толщина (мкм) (среднее значение из 10 приблизительно равноудаленных измерений толщины). Средние арифметические значения использовались для дальнейшей описательной статистики. Пиктограммы с измерениями, по одной для каждой группы, показаны на рисунке 3. Поскольку артерии не очищались во время отбора проб, чтобы избежать потери какого-либо потенциального присутствия местного свертывания крови, в просвете нескольких артерий присутствовали эритроциты (эритроциты). .

Рисунок 3
Рисунок 3

Репрезентативные изображения, показывающие измерения, по одному изображению на группу лечения. Paragon, объектив × 20. На изображениях показаны параметры измерения, внешняя эластичная пластинка (EEL), внутренняя эластичная пластинка (IEL), просвет, внутренняя оболочка и среда. Для измерения внутренней толщины использовали десять изометрических измерений. а полимер А; ПЛГ Поли (молочно-Делиться– гликолевая кислота); Б Б. полимер Народно-освободительная армия Китая полимолочная кислота; малая доза); М средняя (доза), час высокая доза); с Металлическая стойка Rontes; доктор Xience Pro everolimus Filter Coronary Stent System, сосудистый апатит; ЭФ и ЭГ Стенты Rontis everolimus с использованием полимеров A и B соответственно. РА Ретиноевая кислота.

статистический анализ

Статистические тесты проводились с использованием программного обеспечения Prism 8 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Использовали описательную статистику центральной области, внутренней области, стеноза и внутренней толщины. Был проведен тест Шапиро-Уилка на нормальность. Когда данные соответствовали нормальному распределению, сравнения проводились с помощью непарного t-критерия. Когда данные не соответствовали нормальному распределению, использовался критерий Манна-Уитни. Значение р менее 0,05 считалось значимым.

Leave a Comment