Большая опосредованная редактором коррекция болезнетворной мутации у чистокровных собак

Заявление об этике

Экспериментальные процедуры и методы, использованные в этом исследовании, были одобрены Бюро этики и благополучия животных (2019012A-CNU-174) Национального университета Чунгнам, Тэджон, и проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». опубликовано IACUC Национального университета Чунгнам. В этом исследовании в качестве доноров яйцеклеток и реципиентов переноса эмбрионов использовались смешанные самки собак в возрасте от 2 до 6 лет. Собак содержали в помещении и кормили один раз в день водой по желанию. Все методы представлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE (https://arriveguidelines.org) для отчетов об экспериментах на животных в разделе «Методы».

Конструирование главного редактора вектора и получение лентивирусных частиц

Вектор PE был приобретен у Addgene (Watertown, MA, USA: #135955) и модифицирован для исправления связанных с HD полиморфизмов. Вкратце, промотор CMV был получен с помощью ПЦР с использованием наборов праймеров 5′-gaattcttgacattgattgactag-3 и 5′-tctagaaatttcgataagccagtaagc-3 и вставлен в вектор с помощью Эхо см. И XbaI (NEB Inc., Массачусетс, США: #R0101M и #R0145M) Ферментативное восстановление. пегРНК, нацеленная на локус HD, была вновь синтезирована, а затем добавлена ​​к вектору с доллар (NEB Inc., Массачусетс, США: #R0547S) и Эхо см.. Наконец, вектор был подтвержден секвенированием. Лентивирусные частицы вектора PE были произведены коммерческим поставщиком (Lugen SCI, Inc., Пучхон, Южная Корея).

Сбор и создание линий собачьих фибробластов, трансформация и генный анализ

Фибробласты были собраны из ушей 18-месячного лабрадора-ретривера с диагнозом HD (пациент-донор). Первичные фибробласты культивировали in vitro с культуральной средой, состоящей из DMEM-GlutaMAX, 15% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора пенициллина/стрептомицина (GIBCO, Inc.). Для трансдукции 100 MOI лентивирусных частиц PE, содержащих 1 мкг/мл полипрена, трансформировали в 1 × 105 фибробластов на лунку 12-луночного планшета. Экспрессия гена была подтверждена EGFP, а интеграция носителя была подтверждена анализом последовательности.

Сбор зрелых ооцитов in vivo

Мы собрали зрелые ооциты у собак, как описано ранее.27. Концентрацию прогестерона в сыворотке измеряли для улучшения концентрации гормона для сбора зрелых ооцитов. После определения времени эструса собирали кровь и измеряли уровень прогестерона с помощью VET Chroma (ANIVT Inc., Чхунчхон, Южная Корея). Когда анализируемый уровень прогестерона находился в пределах 4-7 нг/мл, мы считали этот день овуляцией. Через три дня после овуляции хирургическим путем собирали зрелые ооциты. Во время процедуры всем собакам вводили кетамин и ксилазин в концентрации 6 мг/кг, анестезию поддерживали 2% изофлураном. После обнажения яичников и матки внутривенный катетер 24G вводили в просвет яйцевода рядом с маточно-трубчатым соединением, и культуральная среда вытекала наружу для сбора зрелых ооцитов. Культуральную среду готовили добавлением 2 мМ NaHCO.31% пенициллин/стрептомицин, 0,5% бычий сывороточный альбумин и 10% FBS в среду 199, содержащую 25 мМ HEPES.

Перенос эмбрионов и перенос эмбрионов

Для создания генетически скорректированных собак, перенос ядер соматических клеток с последующим переносом эмбрионов в соответствии с методом, описанным в другом месте.27. Вкратце, для микроманипуляций использовали зрелые ооциты in vivo с первым полярным тельцем. Метафазные хромосомы удаляли аспирацией из ооцитов. Одну клетку (C>T-клетка) переносили в периферическое пространство удаленных ооцитов, и каждую пару донорских клеток сливали с цитобластами двумя импульсами постоянного тока (24–26 В в течение 15 мкс) с использованием устройства для электрофореза слияния клеток. Слитые эмбрионы SCNT химически активировали путем инкубации с 10 мкМ ионного кальция (Sigma), а затем с 1,9 мМ 6-диметиламинопурина (6-DMAP). Активированные эмбрионы SCNT были хирургическим путем перенесены в яйцеводы для суррогатных матерей, синхронных по эструсу. Беременность была подтверждена УЗИ через 30 дней после переноса эмбрионов.

ПЦР-валидация и анализ последовательности

Интеграцию трансгенных генов в геномы трансгенных фибробластов и трансгенных собак подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры ПЦР, используемые для проверки последовательностей Cas9 в векторе, представляли собой 5′-catcgctattaccatggtgat-3 и 5′-ctcttgcagatagcagatcc-3. Эти наборы праймеров выявили ассоциацию между промотором CMV и dCas9 вектора, используемого в этом исследовании. Секвенирование сайта-мишени проводили для проверки генной коррекции, опосредованной PE. Используемые праймеры последовательности представляли собой 5′-gacgccaagggagcagatatt-3 и 5′-cctcttatgagaacagcat-3 (Bioneer Inc., Тэджон, Южная Корея). Кроме того, клонирование ТА было выполнено для анализа микросеквенирования с использованием продуктов, полученных с помощью ПЦР (приложение, рисунок 1). Продукты ПЦР и Т-вектор (Promega Inc., WI, USA: #A1360) смешивали в соотношении 1:3, ДНК выделяли и очищали из бактериальной колонии, полученной лигированием (NEB Inc., MA, USA: #M0202). ) для выделения ДНК. После подтверждения ДНК, экстрагированной с помощью Эхо см. ферментом рестрикции был проведен секвенирующий анализ.

Анализ нецелевых мутаций у трансгенных собак

Потенциальные нецелевые сайты были идентифицированы in silico с использованием Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Мы выбрали два потенциальных нецелевых локуса с несоответствием и еще три с тремя несоответствиями по сравнению с целевыми последовательностями гена пегРНК, использованными в исследовании. Потенциальные нецелевые локусы амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК C>T dog#1 и C>Tdog#2 и проводили анализ последовательности (дополнительная таблица 2).

Согласие на соблюдение этических норм и согласие на передачу

При проведении этого исследования мы собрали клетки у ретривера с дисплазией тазобедренного сустава, и это было сделано после того, как владельцу ретривера объяснили суть исследования и было получено согласие. Экспериментальные процедуры и методы, используемые в этом исследовании, были одобрены Управлением по этике и благополучию животных (CNU-01090) Национального университета Чунгнам, Тэджон, и проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным IACUC. Чунгнам. Национальный университет. Все методы представлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE (https://arriveguidelines.org) для отчетов об экспериментах на животных в разделе «Методы».

Опубликовать утверждение

не применять.

Leave a Comment