Однократная иммунизация модифицированной векторной вакциной для Анкары Вакцина А, которая производит частицы, подобные суданскому вирусу, защищает от смертельной инфекции.

Создание и характеристика вакцины MVA-VLP-SUDV.

Конструирование вакцины MVA-SUDV-VLP осуществляли, как описано ранее.12 Использование изоляции SUDV последовательности GP EboSud-603 2012 (номер записи GenBank KC545390)25 Последовательность изолята EBOV EBOV/H.sapiens-tc/GAB/1996/1kot VP40 (номер записи в GenBank KC242798)26. Последовательность GP между двумя коровыми генами вакцины (I8R и G1L) встраивали с использованием челночного вектора pLW73, а последовательность VP40 вставляли в модифицированный и реструктурированный сайт вставки III с использованием челночного вектора pLW76 (Wyatt and Moss, неопубликованные данные). Чтобы подтвердить экспрессию GP и VP40, клетки DF1 трансфицировали исходным MVA-VLP-SUDV или MVA (пустой вектор) при множественности заражения 0,5 БОЕ/клетку в течение 48 ч при 37 °C. Затем клетки лизировали и белки разделяли с помощью SDS-PAGE в денатурирующих восстанавливающих условиях. Белки переносили на нитроцеллюлозу, мембрану окрашивали анти-SUDV GP (разведение 1:1000, IBT кат. № 0202-029) и анти-EBOV VP40 (разведение 1:1000, IBT кат. № 0301-010) и визуализировали с помощью Система визуализации LI -COR Odyssey с использованием козьего антикроличьего IgG AlexaFluor680 (Invitrogen cat # 21109) в разведении 1: 10000. Чтобы подтвердить образование VLP с помощью электронной микроскопии, клетки HEK293 были инфицированы MVA-VLP-SUDV в течение 24 часов, окрашивали кроличьим антителом против GP, фиксировали 1% глутаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере и инкубировали в 50 мМ глицина для предотвращения остаточного альдегида. После инкубации с козьим антикроличьим вторичным антителом IgG, конъюгированным с золотыми частицами размером 6 нм (разведение 1:2000, Aurion кат. № 800.011), на JEOL JEM-1400 выполняли усиление серебром для увеличения размера золотых частиц для последующего просмотра. электронный микроскоп в Центре Роберта П. Апкаряна Emory Integrated Core Facility Microscopy (EICF),

Вакцинация и SUV Challenge

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных. UTMB является учреждением, аккредитованным AAALAC, и все работы с животными одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных UTMB. Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных, и все процедуры, связанные с потенциальной болью, проводились с использованием соответствующей анестезии или анальгетиков. Количество животных, использованных в этом исследовании, было научно обосновано на основе статистического анализа вирусологических и иммунологических данных. Девятинедельных самок морских свинок Duncan Hartley (Charles Rivers Laboratories) анестезировали изофлураном для всех процедур. В дни 0 и 29 животные в группе первичной/бустерной вакцины (н= 5) Ей сделали прививку 108 ТКИД50 в объеме 100 мкл внутримышечно, в то время как животные контрольной группы (н= 5) Внесите 100 мкл физиологического раствора. На 29-е сутки животные находились в группе основной вакцинации (н= 5) Ей сделали прививку 108 ТКИД50 в объеме 100 мкл внутримышечно. Забор крови проводили из ретроградной орбиты на -5-е сутки (за пять дней до первой иммунизации), 27-е и 54-е сутки. На 56-е сутки вакцинированным и контрольным животным внутрибрюшинно вводили целевую дозу 103 PFU адаптированного к морской свинке внедорожника внутрибрюшинным путем. За животными наблюдали до трех раз в день на предмет потери веса и признаков болезни и подвергали эвтаназии, когда они достигали умирающего состояния. Остальные животные были подвергнуты эвтаназии через 28 дней после заражения. Сбор крови осуществляли в ретроградной орбите через 3, 6, 9, 12 и 28 дней после заражения и во время эвтаназии.

реакция связывания антител

Образцы сыворотки тестировали на их способность связывать SUDV с полноразмерным GP (IBT Bioservices, #0502-015) и ∆mucin GP SUDV с отсутствующими аминокислотами 314-472 (IBT Bioservices, #0512-015) с помощью ELISA.27. Вкратце, 96 планшетов с плоским дном покрывали в течение ночи при комнатной температуре 8 нг на лунку рекомбинантных белков, разведенных в фосфатно-солевом буфере (PBS). Планшеты пять раз промывали в PBS с 0,1% Tween 20 и блокировали 3% сухим молоком в PBS на 1 час при 37°C. После блокирования готовили 4-кратные разведения сыворотки морской свинки в блокирующем буфере и инкубировали на планшетах, покрытых GP, в течение 1 ч при 37 °C. Планшеты промывали, как указано выше, и инкубировали с конъюгированным с пероксидазой козьего антитела морской свинки в разведении 1:5000 (Jackson ImmunoResearch, кат. № 106-035-003) в течение 1 ч при 37°C. Планшеты промывали, как указано выше, проявляли с использованием субстратной системы SureBlue ELISA (SeraCare) и измеряли интенсивность окраски при 630 нм на устройстве для считывания микропланшетов BioTek Synergy HT.

Пептидный микрочип SUDV GP

167 пептидов из 15 остатков, перекрывающихся 4 аминокислотами, были сконструированы для охвата последовательности SUDV GP (вирус Sudan/H.sapiens-tc/UGA/2000/Gulu-200011676). Пептиды были синтезированы и зафиксированы на предметных стеклах компанией JPT Peptide Technologies. Оба пептида были нанесены на их N-конец в трех экземплярах, чтобы сформировать один блок блота, и 21 блок был нанесен на предметное стекло. Образцы сыворотки в разведении 1:200 (по 3 животных на момент времени в дни 0, 28 и 56) инкубировали в течение 1 ч при 30 °C с последующими 4 промывками в промывочном буфере JPT (1x TBS-буфер (20 мМ Трис, 136 мМ ).моль NaCl, pH 7,4) + 0,1% Tween 20 (TBS-T)). Затем блоки инкубировали в 0,1 мкг/мл антитела морской свинки, конъюгированного с Cy5 (Jackson ImmunoResearch, кат. № 706-175-148), с последующими четырьмя промываниями. После дополнительной промывки в деионизированной воде предметное стекло высушивали центрифугированием. Флуоресцентные показания каждого пятна регистрировали в системе GenePix 4000b (Molecular Devices) и анализировали с использованием программного обеспечения GenePix Pro 7 (Molecular Devices).

Нейтрализация ответа антител

Сыворотку морской свинки тестировали на нейтрализацию против SUDV Gulu, а также EBOV Mayinga и BDBV Uganda. Вкратце, образцы сыворотки подвергали тепловой инактивации в течение 30 минут при 56 °C и разбавляли двойным серийным способом в MEM (Gibco) с HEPES (Corning), сульфатом гентамицина (Cellgro) и 10% добавками для морских свинок (MP Biomedicals). Пятьдесят мкл каждого разбавителя сыворотки смешивали с 200 БОЕ вируса в 50 мкл. Смеси сыворотка/вирус инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем 50 мкл смесей сыворотки/вируса переносили в монослои клеток Vero E6 в 96-луночных чашках с плоским дном и инкубировали в течение 1 часа при 37 °C. Смесь сыворотки/вируса удаляли и заменяли слоем 1:1 из 1% метилцеллюлозы (Fisher Chemical) и 2X MEM (Gibco) с добавлением сульфата гентамицина (Corning) и 4% FBS (Gibco). Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37 °C, затем фиксировали 10% нейтральным формалином Fisherbrand (ThermoFisher Scientific) в соответствии с утвержденной СОП и удаляли из биозащиты. Планшеты промывали 3 раза 1X DPBS (Corning) и блокировали 1X DPBS с 5% молока на 1 час. Для визуализации бляшек SUDV монослои иммунизировали 1 мкг/мл mAb BDBV43 (подарок Джеймса Кроу, Медицинский центр Университета Вандербильта) в качестве первичного антитела. Планшеты промывали три раза в 1X DPBS перед добавлением конъюгированного козьего античеловеческого HRP (SeraCare, кат. № 5220-0330) в разведении 1:2000 в качестве вторичного антитела. Бляшки EBOV визуализировали с помощью козьей анти-EBOV сыворотки в разведении 1:1000 (подарок от Thomas Ksiazek, UTMB) и HRP-конъюгированного козьего бычьего IgG в разведении 1:2000 (Jackson ImmunoResearch, кат. Бляшки BDBV окрашивали 1 мкг/мл mAb BDBV52 (подарок от James Crowe, Vanderbilt) и HRP, конъюгированным с козьим античеловеческим IgG в разведении 1:2000 (SeraCare, № по каталогу 5220-0330). Первичные и вторичные антитела разводили в блотто (5% раствор сухого обезжиренного молока в PBS). Наконец, планшеты трижды промывали в 1X DPBS (Corning) и планшеты визуализировали путем инкубации с субстратом AEC (Bioregents Query) при 37 °C в течение 30 мин.

фагоцитоз, опосредованный антителами

Рекомбинантный биотиниловый SUDV GP рекомбинировали и конъюгировали с 1 мкМ FITC.+ Нейтравидин в таблетках (Life Technologies). Вкратце, биотин удаляли из SUDV GP с использованием биотина Sulfo-NHS-LC-LC (ThermoFisher Scientific), а избыток биотина удаляли с помощью колонки для обессоливания Zeba (ThermoFisher Scientific). Биотинилированный SUDV GP инкубировали с флуоресцентными гранулами, покрытыми нейтрофином (ThermoFisher Scientific), при 4°C в течение ночи (1 мкг биотинилированного белка на 1 мкл гранул). Осадки дважды промывали 0,1% поверхности тела в PBS и ресуспендировали в 100 мкл 0,1% площади поверхности тела в PBS на каждый 1 мкл парных гранул. Сыворотки вакцинированных морских свинок разбавляли 1:100 в среде для культивирования клеток и инкубировали с гранулами, покрытыми GP, в течение 2 ч при 37 °C. Добавляли свежевыделенные нейтрофилы из донорской крови в концентрации 5,0×10 .4 Клетки на лунку и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Клетки окрашивали в соотношении 1:100 CD66b (Pacific Blue, Clone G10F5; Biolegend, кат. № 305111), фиксировали 4% параформальдегидом и анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре Sartorius iQue, при этом было зарегистрировано не менее 30 000 событий. Это. Нейтрофилы были определены как SSC-Aвысокая CD66b+. Степень фагоцитоза определяли по следующей формуле: (процент ФИТЦ+ клеток) x (средняя интенсивность флуоресценции (MFI) FITC+ ячеек) / 10 000.

Опосредованный антителами клеточный фагоцитоз моноцитами человека

Рекомбинантный биотиниловый SUDV GP рекомбинировали и конъюгировали с 1 мкМ FITC.+ Нейтравидин в таблетках. Образцы сыворотки иммунизированных морских свинок разбавляли 1:500 в культуральной среде и инкубировали с гранулами, покрытыми GP, в течение 2 часов при 37 °C с последующим добавлением клеток в течение 18 часов. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и анализировали на проточном цитометре Sartorius iQue, регистрировали и анализировали не менее 10 000 событий. Степень фагоцитоза определяли, как описано выше.

Преципитация комплемента, опосредованная антителами

Рекомбинантный биотинилированный SUDV GP рекомбинировали и связывали с красными нейтравидиновыми гранулами размером 1 мкм. Сыворотку вакцинированных морских свинок разбавляли 1:10, 1:100 и 1:200 в культуральной среде и инкубировали с гранулами, покрытыми GP, в течение 2 ч при 37 °C с последующим добавлением восстановленной добавки для морских свинок (Cedarlane Labs), разведенной в буфере Желатинизированный, содержащий магний и кальций (Boston Bioproducts) и инкубированный в течение 20 минут при 37°С. Осадки дважды промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 15 мМ ЭДТА, и окрашивали FITC-конъюгированным антителом С3 морской свинки (1:100, MP Biomedicals, кат. № 0855385). Отложение C3 на гранулах анализировали на проточном цитометре Sartorius iQue, и было зарегистрировано и проанализировано не менее 10 000 событий. Отложение C3 рассчитывали по следующей формуле: (средняя геометрическая интенсивность флуоресценции FITC для всех шариков) x (% FITC + шарики)/10000.

вирусемия анализ

Виремию определяли путем титрования образцов сыворотки, полученных после заражения SUDV, с помощью анализа бляшек на клетках Vero E6. Образцы сыворотки серийно разводили в соотношении 1:10 в 1X MEM (Gibco) с добавлением сульфата гентамицина (Corning) и 2% FBS (Gibco). Затем 50 мкл серийных разведений переносили в монослои клеток Vero E6 в 96-луночных планшетах с плоским дном и инкубировали в течение 1 часа при 37 °C. Затем разведения удаляли и заменяли слоем 1:1 1% метилцеллюлозы (Fisher Chemical) и 2X MEM (Gibco) с добавлением сульфата гентамицина (Corning) и 4% FBS (Gibco). Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37 °C, затем фиксировали 10% нейтральным формалином (Fisherbrand) в соответствии с утвержденными СОП и удаляли из биозащиты. Вирусные бляшки SUDV иммунизировали с использованием того же метода, который описан выше для анализа нейтрализации.

Биоконтейнерный бизнес

Работа с инфекционными вирусами SUDV, EBOV и BDBV проводилась на установках BSL-4 Галвестонской национальной лаборатории. Сотрудники прошли соответствующее обучение, имеют разрешения правительства США и регистрацию для работы с файловыми вирусами.

статистический анализ

2-факторный дисперсионный анализ с последующим пост-тестом Бонферрони; Анализ Крускала-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна и тестом Log Rank (Mantel Cox) выполняли с использованием GraphPad Prism для Windows (версия 6.07). с<0,05 считалось значимым.

Сводка отчета

Более подробная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Leave a Comment