Болезни Киари у дельфинов | Научные отчеты

экспертиза животных

Сеть плетения морских млекопитающих Канарских островов провела более 1200 вскрытий выброшенных на берег китообразных, в том числе 172 полосатых дельфина (Стенелла голубовато-белая). Из них у 4 (2%) полосатых дельфинов был диагностирован ХЛЛ, аналогичный или идентичный ранее описанному у дельфинов Риссо, обыкновенных дельфинов и морских свиней.1,2. Это исследование было сосредоточено на этих четырех полосатых дельфинах. Биологические данные и эпидемиология правонарушений для каждого человека приведены в Таблице 1. Возрастная группа основывалась на общей длине тела и развитии гонад, включая плод/новорожденный/детеныш, молодой/половозрелый и взрослый.14, 15, 16. Нутритивный статус (синхронное состояние тела) субъективно классифицировали на хороший, средний, плохой и худой по таким анатомическим критериям, как выступание отростков, остистые и поперечные ребра, супрааксиальная мышечная масса, количество жировых отложений с учетом вид и возраст животного14, 15. Тела были классифицированы как очень свежие, свежие, со средним автолизом, продвинутым аутолизом или очень продвинутым аутолизом.14, 15, 16, 17.

Разрешение, необходимое для обращения с выброшенными на берег китообразными, было выдано Департаментом окружающей среды правительства Канарских островов и Министерством окружающей среды Испании. Эксперименты на живых животных не проводились.

Патологические исследования

Вскрытие проводится по стандартизированным протоколам.14, 15, 16, 17. репрезентативные образцы кожи, длиннейшая мышца спины И прямой живот Мышцы, брюшина, диафрагма, центральная нервная система, глаз, мешок век, комплексы барабанной перепонки, язык, слизистая оболочка полости рта, глоточные миндалины и гортань, пищевод, желудок, тонкий и толстый кишечник, печень, поджелудочная железа, трахея, легкие, сердце, артерии аорта, почку, мочеточник, мочевой пузырь, уретру, лимфатические узлы, селезенку, яичко, половой член, крайнюю плоть, яичник, матку, влагалище и вульву собирали и фиксировали в нейтральном 10% формалине. Все эти ткани обрабатывали обычным образом, заливали в парафин и срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для микроскопического анализа. Специальные гистохимические методы (толщиной 4–10 мкм), чтобы лучше охарактеризовать микроскопические признаки ХЛЛ, включали периодическую кислоту-Шиффа, трихром Массона, пикросериус красный, жемчужный и вартин-старый.

Иммуноанализ

Мы использовали набор первичных антител для иммуногистохимического (ИГХ) анализа, чтобы лучше охарактеризовать ХЛЛ. В качестве первичного антитела использовали фактор (F)-VIII (фактор фон Виллебранда) для эндотелиальных клеток и тромбоцитов. фибриноген, как агент фибриногена/фибриногена (свертывания крови); Панцитокератин AE1/AE3 и цитокератин 5, 8 и 18 эпителия желчных протоков; и виментин как общий маркер мезенхимальных филаментов мезенхимальных стромальных клеток. Соблюдались опубликованные методики анализа ИГХ.18,19. Подробная информация о методологии IHC записана в дополнительной таблице S2. Отрицательный контроль состоял из серийных срезов ткани, в которых первичное антитело было заменено гомологичной неиммунной сывороткой. Положительный контроль включал печень внутреннего и внешнего полосатого дельфина с ее природными компонентами.

Анализ полимеразной цепной реакции

При вскрытии отобранные образцы собирали для анализа на вирусы и хранили в замороженном виде при температуре -80 °C до обработки для молекулярно-вирусологического тестирования. Приблизительно 0,5 г образца свежезамороженной ткани от каждого животного механически лизировали в лизирующем буфере, а затем центрифугировали. Экстракцию ДНК/РНК из каждого 300 мкл образца, дренированного под давлением, проводили с использованием изолятора ДНК QuickGene R Mini 80 с использованием набора ДНК Tissue Kit S (QuickGene, Kurabo, Japan) в соответствии с инструкциями производителя с изменениями: Добавление векторной РНК (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Waltham, Массачусетс, США) на стадии лизиса20. ДНК вируса герпеса выявляли с помощью обычной гнездовой полимеразной цепной реакции с использованием вырожденных праймеров, предназначенных для амплификации участка гена ДНК-полимеразы.21. Молекулярное обнаружение морфовируса китообразных (CeMV) проводили с помощью одного или нескольких из четырех различных методов полимеразной цепной реакции: одностадийной ОТ-ПЦР для защищенной области 426 п.н. гена фосфопротеина (P).22одноэтапная ОТ-ПЦР в реальном времени выявляет наиболее распространенные штаммы ЦМВ, которые, как известно, циркулируют в Атлантике и нацелены на ген P.23и ОТ-ПЦР с использованием вложенных праймеров, нацеленных на P.24и одноэтапная ОТ-ПЦР для обнаружения последовательностей в консервативной области (192 п.н.) гена слитого белка (F).20. Молекулярное обнаружение Бартонелла Преследование. Дополнительно с помощью ПЦР в реальном времени с использованием SYBR® Зеленый, как описано ранее25.

Отбор проб и анализ газа

Образцы газа были взяты из CLL случаев 3 и 4 и кишечника случая 1. Чтобы предотвратить загрязнение атмосферного воздуха, печень была погружена в дистиллированную воду, а образцы газа были взяты с помощью аспиратора (ES1076326) в соответствии с Bernaldo de Quiros et al. .8. Пробы газа собирались и хранились в стеклянных прокладках объемом 5 мл без добавок.® (BD Vacutainer® Z. Ref: 367624) и анализировали с помощью газовой хроматографии в течение двух недель после сбора образца. Пробы газа извлекали из пустот и вводили в газовый хроматограф (Varian 450-GC) с помощью стеклянных шприцев под давлением (серия Supelco A-2). Пробы газа пропускали в течение 15 минут при 45°С и постоянном давлении 13,1 фунтов на кв. дюйм через колонку Varian 450-GC и детектор по теплопроводности, а также пламенно-ионизационный детектор с использованием гелия в качестве газа-носителя.8. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение в мкмоль%.

томография

Нормальную печень полосатого взрослого дельфина (для сравнения) исследовали с использованием 16-срезового спирального томографа (Toshiba Astelion, Toshiba Medical System, Мадрид, Испания) при следующих настройках: 16 массивов обнаружения; Тип набора: спираль. Толщина: 1 мм; Интервал восстановления изображения: 0,8 мм; шаг: 1; Время вращения трубки: 0,75; 250 мА; кВ: 120; поле зрения: 512 х 512; размеры матрицы: 1204 х 845; WW 500 / WL 505. Печень предварительно вскрыта. Каудальную полую вену и воротную вену выделяли и обрабатывали отдельно. Эти сосуды промывали водопроводной водой, после чего в обе вены вводили радиоактивное контрастное вещество (Иомерон 300©) с физиологическим раствором. Полученные изображения DICOM были проанализированы. Окно мягких тканей (WW 500/WL 50) было применено для просмотра внутреннего объема и, таким образом, получения 3D-модели венозной, портальной и печеночной систем.

Анализ слепков печени

Чтобы получить подробную оценку сосудистой сети печени, мы выполнили шаблон эрозии на контрольной карте дельфина (сравнительные цели) в соответствии с опубликованными методологиями.26, 27. При вскрытии каудальную полую вену, воротную вену, печеночную артерию и желчный проток тщательно рассекали, изолировали и промывали водопроводной водой. Далее аккуратно вырезали и отделяли печень от поддерживающих сосудов с сохранением капсулы и ее связок (извлекали часть диафрагмы и меньший сальник). После извлечения печень тщательно промывали. Ex situ катетеризировали общий желчный проток, печеночную артерию, воротную вену, полую вену и каудально у дорсального края печени. Накладывается левая ветвь каудальной полой вены. Затем в венозные сосуды, артериолы и желчные протоки вводили синюю, белую, красную и желтую эпоксидную смолу (Biodur©). Печень хранили при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем при 4°С в течение 24 часов. Затем над печенью, погруженной в 10% раствор гидроксида натрия (NaOH) на две недели, применяли эрозионный процесс. Обломки мягких тканей удаляли вручную.

бактериологические анализы

Свежие образцы тканей (кожи, мышц, легких, предплечевых лимфатических узлов, легких, средостения, брыжейки, печени, кишечника, почек, селезенки и мозга) обычно собирали во время вскрытия, замораживали (-80 °C) и выборочно подвергали бактериологическому исследованию. анализ. К ним относятся стандартное культивирование и поверхностное покрытие на обычных средах, Например. , колумбийский кровяной агар и первоначальная идентификация изолятов с помощью API® система (API® 20Е, API® Быстрый 20E, API® нотоносец, API® 20 стрептококк, API® Коринн, API® 20а). Полимеразную цепную реакцию, нацеленную на ген 16S рРНК, проводили вместе с импульсным гель-электрофорезом на выбранных изолятах.

Leave a Comment