Надежная остеогенетическая эффективность 2α-гетероарилалкильного аналога витамина D AH-1 в модели VDR (R270L) витамин D-зависимого генетического рахита.

Материалы

AH-1 был синтезирован, как описано ранее.19. D6-25-гидроксивитамин D3 (26,26,26,27,27,27-д6, д6-25 (о) д3) и органические растворители класса LCMS от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). 4-[2-(6,7-dimethoxy-4-methyl-3-oxo-3,4-dihydroquinoxalyl)ethyl]1,2,4-триазолин-3,5-дион (DMEQ-TAD) был приобретен у FUJIFILM Wako Pure Chemicals (Осака, Япония). Оригинальные стандарты 24R, 25 (ОН)2доктор3и 24-оксо-25 (ОН) d3 Приготовлено, как описано выше25. Другие химикаты были коммерчески доступны и имели высокое качество.

Анализ комплементарной люциферазы in vitro

Белки биосенсора LucC-rat LBD (R270L)-LucN были созданы и экспрессированы, как описано в наших предыдущих отчетах.20,21,22. кишечная палочка бактерии LBD(R270L)-LucN-содержащие лизаты крыс LucC использовали для анализа люциферазы комплемента in vitro.

Раствор разбавляли реакционным раствором. [25 mM Tris–HCl (pH 7.4), 2 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA] Общий объем доводили до 50 мкл. Трехмерное разведение биосенсора LucC-rat LBD (R270L)-LucN помещали в 96-луночные планшеты. Далее, 25 (о) д31,25 (о)2доктор3, или AH-1 в этаноле в лунку при 0-10000 нм и инкубируют при комнатной температуре (23-26 ℃) в течение 30 мин (до инкубации). Затем 50 мкл раствора люциферина [25 mM Tris–HCl (pH 7.4), 20 mM MgSO4, 2 mM d-Luciferin (Thermo Scientific, CA, USA) and 4 mM ATP] Его вводили в 96-луночные планшеты. Через 30 мин после добавления раствора люциферина измеряли интенсивность света с помощью люминометра (Infinite 200 Pro M Plex, TECAN). В этом исследовании относительная интенсивность света в присутствии 25(OH)D31,25 (о)2доктор3 или AH-1 рассчитывали путем сравнения с интенсивностью света в отсутствие связей (0 нМ = 1% EtOH).

Расчетное связывание белок-лиганд между Vdr (R270L) и лигандами

Модели были созданы на основе рентгеновской кристаллической структуры мутантного белка (идентификатор pdb: 3VT3).26 с 1,25 (ОН)2доктор3 Как это. Первоначальная форма связывания in situ была минимизирована в месте связывания VDR в сложной структуре с помощью силового поля CHARMm.40. Для моделирования взаимодействия между Vdr(R270L) и AH-1 модели докинга безлигандных AH-1 и Vdr(R270L) были получены с использованием моделирования CDOCKER.41. Форма наилучшего места для стыковки на площадке была минимизирована с использованием аналогичного метода, описанного выше. Энергии связи были рассчитаны с использованием окончательно полученных сложных структур и перечислены в дополнительной таблице 2.

Животные и еда

Вейдер(R270L) были созданы с помощью системы редактирования генома CRISPR-Cas9, как описано ранее.11 Гетерозиготные и гетерозиготные скрещивались друг с другом для получения гомозиготных и диких видов. Крыс содержали при контролируемой комнатной температуре (22–26 °C) и влажности 50–55% с 12-часовым циклом свет/темнота. Им давали есть и пить, чтобы они насытились, и соблюдали диету, содержащую формулу F-2, содержащую 0,75% кальция и 2000 МЕ витамина D/кг.11.

Упомянуть Вейдер(R270L) Мышей разделили на три группы. Контроль носителя (KI), низкие дозы AH-1 (KI + AH-L, 1 мкг/кг/день) и высокие дозы AH-1 (KI + AH-H, 5 мкг/кг/день). Исходный раствор АН-1 в EtOH растворяли в кукурузном масле для групп АН-1. Эквивалентный объем EtOH растворяли в кукурузном масле для контрольных групп дикого типа и носителя. Вейдер(R270L) мутант. Реагенты вводили перорально крысам 5 раз в неделю в возрасте от 6 до 15 недель. Кровь забирали из яремной вены в шприц, наполненный гепарином, под анестезией изофлураном в следующие конечные точки жизни; 6, 8, 10, 12 и 15 недель. Кровь вышла на 3000грамм в течение 10 минут для получения плазмы. Образцы плазмы хранили при температуре -80 °C до последующих экспериментов (рис. 3а).

Через 24 часа после последнего введения крыс умерщвляли под анестезией изофлураном и собирали ткани после сбора крови. Слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки и кусочки коркового вещества почек немедленно пропитывали ISOGEN II (Nippon Gene Co., Ltd, Токио, Япония) и гомогенизировали, а затем хранили при температуре -80 °C до последующих экспериментов. Бедра замачивали в 70% этаноле и хранили при 4°С.

Для анализа плазменного клиренса AH-1 вводили 50 мкг/кг AH-1. Вейдер(R270L) 15-недельные мыши. После однократных доз кровь собирали в следующих конечных точках; 0, 1, 2, 6, 12, 24 ч после введения (рис. 3б).

Все экспериментальные протоколы с использованием животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных префектурного университета Тояма и были одобрены Комитетом по исследованиям и этике животных Университета Тоямы.

томография

Чтобы изучить морфологические характеристики и характеристики МПК, был проведен анализ компьютерной томографии (мкКТ), как описано ранее.11. Вкратце, бедра исследовали с помощью рентгеновской КТ (Latheta LCT-200; Hitachi Aloka Medical, Токио, Япония) при напряжении 50 кВпик, токе 500 мкА, времени интегрирования 3,6 мс и осевом поле зрения 48 мм. , с изотропным размером вокселя 48 мкм. Содержание минералов в бедренной кости рассчитывали с использованием программного обеспечения LaTheta (Hitachi Aloka Medical). Пороговая плотность 160 мг/см3 Он был выбран, чтобы отличить минерализованные ткани от неметаллических тканей. Трехмерные изображения бедренной кости были созданы из изображений, отсканированных с помощью программного обеспечения VGSTUDIO 3.2 (Graphics Volume, Гейдельберг, Германия).

Измерение параметров метаболизма кальция в плазме

Концентрацию кальция в плазме измеряли с помощью E-Test Wako Calcium Test (FUJIFILM Wako Wako Pure Chemical, Осака, Япония). Концентрацию паратиреоидного гормона (ПТГ) в плазме определяли с использованием набора ELISA для здорового крысиного ПТГ (Immutopics Inc., Сан-Клементе, Калифорния, США). Плазменная концентрация 1,25 (ОН)2доктор3 Это было измерено с 1,25-(ОН)2 Набор Elisa Kit с витамином D (Immundiagnostik, Бенсхайм, Германия), как описано ранее.11.

Количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и коры почек с использованием ISOGEN II (Nippon Gene, Токио, Япония). (кДНК) синтезировали с использованием PrimeScript RT Master Mix (Real Time Perfection) (TaKaRa, Otsu, Japan). ПЦР в реальном времени проводили с помощью системы ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500 с использованием TB Green Premix Ex Taq II (TaKaRa, Otsu, Japan) в качестве реакционного реагента. экспрессия мРНК Cyp24a1И Tpv5 И Кальбиндин D28k Определяют методом ΔΔCt с использованием β-актин в качестве внутреннего контроля (дополнительная таблица 1).

статистический анализ

Анализ выполнялся с помощью IBM SPSS Statics (версия 25). Для анализа минеральной плотности кости, длины бедренной кости, содержания кальция в плазме, ПТГ в плазме и 1,25(ОН) в плазме был выполнен двухсторонний ANOVA.2доктор3и экспрессии мРНК. Различия считали достоверными при p < 0,05 по критерию Бонферрони.

Политика этики

Об этом исследовании сообщалось в соответствии с рекомендациями ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Leave a Comment