Ограничение внутриутробного развития и его влияние на морфологию кишечника во время постнатального развития у свиней

Животные и экспериментальный дизайн

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных (CEUA) Федерального университета штата Минас-Жерайс (Протокол № 2016/342). Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими рекомендациями и правилами CEUA. Сообщите обо всех экспериментальных процедурах, которые соответствуют рекомендациям в Руководстве ARRIVE.

Сто двадцать пар поросят мужского пола, рожденных от третьего до шестого зодиака эквивалентности, с общим весом 15-22 галлона и средней массой тела при рождении 1,25-1,65 кг, были отобраны сразу после рождения, до приема молозива, и разделены на две категории массы тела при рождении: нормальная масса тела при рождении (NW), масса тела при рождении от 1,6 до 1,9 кг (n = 120); Задержка внутриутробного развития (ЗВУР), масса тела при рождении колебалась от 0,7 до 1,0 кг (n = 120). Все оцениваемые животные происходили из одной и той же генетической линии: гибридной линии F1 (Ландрас × крупная белая), скрещивавшейся с самцами дюрок-Agroceres PIC. Выбранная пара NW-IUGR соответствует мужчинам с самой высокой и самой низкой массой тела при рождении из каждой носилки. Критерии, используемые для отбора, были основаны на концепции скученности матки, согласно предыдущим исследованиям.4.17. Для определения диапазонов массы тела при рождении предварительно взвесили 1000 поросят одного генотипа и рассчитали среднее значение и стандартное отклонение (μ = 1,3; ϭ = 0,3). Диапазоны веса при рождении были установлены как от μ + до μ + 2ϭ для СЗ и от μ – ϭ до μ – 2ϭ для ЗВУР.4, 17, 18, 19. Всех самцов кастрировали в возрасте от 5 до 7 дней. Две подгруппы по 16 животных в каждой (8 NW и 8 IUGR) были подвергнуты эвтаназии при рождении или через 48 часов после отъема (возраст 26 дней), а две подгруппы по 20 животных в каждой (10 NW и 10 IUGR) были подвергнуты эвтаназии в возрасте 70 лет. или 150 дней на биометрические данные и сбор тканей. За исключением группы новорожденных, которых усыпляли до приема молозива, всех животных усыпляли после ночного голодания.

Эти возрасты выбраны исходя из характеристики послеродового созревания желудочно-кишечного тракта на основных стадиях производственного цикла: роды (отражающие функцию плаценты); после отъема (переход с молока на твердую пищу); 70 дней (фаза фермы) и 150 дней (фаза отделки).

Биометрия

Индивидуальную массу тела регистрировали при рождении, в возрасте 26, 70 и 150 дней без ограничения корма и воды. Сразу после эвтаназии с помощью электрического тока и обескровливания тонкую кишку извлекали из брюшной полости, взвешивали и регистрировали ее длину. Кроме того, для подтверждения возникновения задержки внутриутробного развития мозг и печень в подгруппе новорожденных были взвешены, чтобы получить соотношение веса мозга и печени, как это было выполнено Alvarenga et al.4.

Сбор и обработка проб

Фрагменты двенадцатиперстной и тощей кишки были собраны из изгибов черепа и двенадцатиперстной кишки соответственно и подвергнуты различным протоколам лечения. Для гистологического анализа срезы (длиной 1–2 см) промывали физиологическим раствором, серозные оболочки прикрепляли к фильтровальной бумаге, фиксировали погружением в 4% параформальдегид на 24 ч и хранили при 4 °С в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4). ) на 24 часа и залиты парапластом (Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия). Затем срезы ткани (толщиной 5 мкм) обезжиривали в ксилоле и регидратировали градуированными разведениями этанола. Предметные стекла окрашивали гематоксилином и эозином (HE) и периодической кислотой-Шиффа (PAS) для морфологических наблюдений и подсчета бокаловидных клеток, соответственно.

Гистологическая оценка

Гистологические срезы оценивали с помощью светового микроскопа (Olympus BX51), а измерения проводили с помощью линейки, вставленной в 10-кратную линзу, откалиброванной микрометрической линейкой. В общей сложности 10 интактных и хорошо направленных оккультных единиц из двенадцатиперстной и тощей кишки были случайным образом выбраны для следующих измерений параметров, как описано ранее.4: (а) высота слизистой оболочки (MH): от мышечная слизистая оболочка до верхушки ворсинки; (b) Высота ворсинок (VH) от основания до вершины ворсинок; (c) Глубина кишечной крипты (DC), от мышечная слизистая оболочка до основания ворсинки и (d) ширину ворсинки (WV) и (e) ширину ворсинки (CW). Кроме того, соотношение между высотой ворсинок и глубиной просвета кишечника (VH/CD), площадью поверхности ворсинок (S) и площадью всасывания в кишечнике (AA) определяли с использованием формул, описанных Dong et al.5 и Киселински и др.20следующим образом:

$$\mathrm{S}: \pi \frac{ворсинки\,ширина}}{2}\sqrt{{\left(\frac{ворсинки\,ширина}}{2}\right)}^{2}+{ворсинки \, высота}^{2}} $$

$$\mathrm{AA}: \frac{\left(ворсинки\, ширина \cdot ворсинки\, высота \справа) + {\left (\frac{ворсинки \, ширина} {2} + \frac{crypt\, widht}{2}\right)}^{2}-{\left(\frac{ворсинки\,width}{2}\right)}^{2}}{\begin{array}{c}\left( \frac{ворсинки\,ширина}{2}+\frac{crypt\,width}{2}\right)\\end{массив}}$$

Гистологические срезы двенадцатиперстной кишки и тощей кишки окрашивали периодической кислотой-Шиффом (PAS) для обнаружения нейтрального миозина (окрашенного в фиолетовый цвет), присутствующего в бокаловидных клетках. Количество бокаловидных клеток определяли с использованием стандартного протокола Gomes et al.21. Для каждого животного случайным образом отбирали десять областей кишечных крипт и получали изображения с помощью оптического микроскопа (BX-51 Olympus), подключенного к цифровой камере Q-Color 3 (Olympus), при 400-кратном увеличении. Все бокаловидные клетки в кодирующих областях каждого изображения были количественно оценены с использованием программного обеспечения Image-Pro Express (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) и уравнения квадратного миллиметра (мм).2).

Экспрессия маркеров пролиферации и апоптоза методом иммунофлуоресценции (ИФ)

Чтобы определить, может ли ЗВУР оказывать влияние на пролиферативную активность и апоптоз эпителия двенадцатиперстной кишки, были проведены иммунофлуоресцентные анализы на Ki67, маркер клеточной пролиферации, и каспазу-3, маркер апоптоза. Пять животных из групп NW и IUGR были выбраны случайным образом. Поскольку морфологические гистологические параметры в тощей кишке были сходными в обеих экспериментальных группах, анализы на пролиферацию и апоптоз не проводили. Вкратце, гистологические срезы двенадцатиперстной кишки депарафинизировали, регидратировали, подвергали микроволновой обработке в течение 3 х 5 минут в 0,1 М буфере цитрата натрия (рН 6) для поиска эпитопного антигена, охлаждали до комнатной температуры и промывали фосфатно-солевым буфером с рН 7. 4. ( ТВ шоу). Для уменьшения неспецифического связывания срезы инкубировали с 3% бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в трис-HCl-буферном растворе (PBS, pH 7,3) в течение 90 минут при 4 °C. Все образцы инкубировали по отдельности в течение ночи при 4 °C с первичным антителом против Ki67 (IgG; 1:200; Thermo Fisher Scientific, Сан-Паулу, Бразилия) или против каспазы 3 (IgG; 1:600; Thermo Fisher Scientific, Сан-Паулу). антитела. Paulo, Бразилия) соответственно. Окрашивание всех слайдов для каждого анализа проводили одновременно за один сеанс. После промывания к срезам добавляли вторичное антитело Alexa Fluor 555 (козий антикроличий IgG, A-21422, Thermo Fisher Scientific, Сан-Паулу, Бразилия), разведенное в соотношении 1:200 (антитело: PBS), и инкубировали в течение 90 мин. , при 4 градусах Цельсия. Наконец, ядра окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в соотношении 1:1000 (DAPI:PBS), а предметные стекла заливали 50% глицерином (об./об. в PBS). Отрицательный контроль был получен путем исключения первичного антитела. Образцы семенников человека использовали в качестве положительного контроля для Ki-67, а ткани опухоли молочной железы собак использовали для каспазы-3. Иммунофлуоресцентные изображения были получены с использованием микроскопа Zeiss Apotome (Carl Zeiss Microscopy, Сан-Паулу, Бразилия), оснащенного соответствующими фильтрами для обнаружения сигналов Alexa Fluor 555.

Для изучения клеточной пролиферации десять случайно выбранных участков кишечной железы (крипты) каждого животного визуализировали при 200-кратном увеличении. Все положительные клетки в эпителии кишечной железы были количественно оценены с использованием программного обеспечения Image-Pro Express (Media Cybernetics, Роквилл, США) и значения выражены как количество иммунокомпетентных клеток на мм2 из кишечных желез.

С другой стороны, анализ каспазы-3 проводили путем определения интенсивности флуоресценции. Были получены микрофотографии с 200-кратным увеличением для каждого животного и 10 случайно выбранных кишечных ворсинок были получены с использованием программного обеспечения Image J (NIH). Перед анализом микрофотографии были преобразованы в черно-белые изображения, а изображение J было выровнено с учетом 100% белого (положительные области) и черного цвета при 0% интенсивности флуоресценции. Значения выражали в виде среднего процента интенсивности флуоресценции.

Определение активности ферментов в тонкой кишке

Для определения ферментативной активности лактазы, амилазы, липазы, химотрипсина и трипсина образцы длиной 2 см из двенадцатиперстной и тощей кишки замораживали в жидком азоте. Для приготовления сырого экстракта образцы по 100 мг гомогенизировали в гомогенизаторе Turrax с использованием 0,01 М фосфатно-солевого буфера (NaCl 0,138 М; KCl-0,0027 М; рН 7,4) в соотношении 1:10 (масса:объем). После центрифугирования при 15000грамм В течение 15 мин при 4°С супернатант собирали и хранили при -20°С для дальнейшего анализа.

Активность фермента измеряли в образцах экстрактов тканей двенадцатиперстной и тощей кишки. Для всех них количество белков в экстрактах ферментов определяли по Бредфорду.22используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандартного белка.

Активность лактазы определяли с помощью а– нитрофенил БдокторГалактопиранозид (ONPG, Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в качестве синтетического субстрата23. В колориметрическом анализе, проведенном при pH 7,4 и 37 °C, ONPG расщеплялся лактазой, которая высвобождала орто-нитрофенол, измеряемый при 420 нм. Активность химотрипсина измеряли по методу Hummel.24 В зависимости от скорости гидролиза субстрата н-бензоил-к-Этилэтиловый эфир (BTEE, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия). Активность трипсина определяли с помощью N.α бензоил-ДелГидрохлорид аргинин-4-нитроанилида (Papna, Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в качестве субстрата по методу Erlanger et al.25. Наконец, активность липазы определяли в соответствии с протоколом, описанным в наборе для тестирования липазы (Analisa Gold, Белу-Оризонти, Бразилия), основанном на усовершенствованном методе димеркаптропанола трибутирата (BALB), в котором SH-группы были образованы из расщепления липазы для реакции BALB с 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) (DTNB) с образованием продукта желтого цвета. Интенсивность окраски, измеренная при 412 нм, была пропорциональна активности фермента в образце. Для оценки активности амилазы использовали набор для анализа амилазы (Annalisa Gold, Белу-Оризонти, Бразилия), основанный на модифицированном методе тмина: амилаза в образце гидролизовала крахмал, высвобождая молекулы сахара и декстрина. После добавления раствора йода в результате комплексообразования с негидролизованным крахмалом образовалась синяя окраска. Таким образом, активность амилазы была обратно пропорциональна интенсивности образующейся синей окраски и рассчитывалась по сравнению с контролем субстрата.

Удельную активность всех ферментов выражали в ед белка/мг, где U определяли как количество фермента, гидролизующего 1 моль субстрата за минуту реакции. Все образцы были проанализированы в двух повторах, и значения поглощения были измерены с использованием спектрофотометра Power Wave™ XS Microplate Scaring Spectrophotometer (Bio-Tek Instruments, Button, UK).

статистический анализ

Все переменные были проверены на нормальность перед анализом с использованием одномерной процедуры системы статистического анализа.26. Данные были проанализированы как полная случайная схема блока, с парами помета, использованными в качестве блока, и свиньи, являющейся экспериментальной единицей. Данные были представлены для дисперсионного анализа (ANOVA), выполненного с помощью общей линейной процедуры SAS, и средние значения сравнивались с помощью критерия Стьюдента-T, при этом значение P <0,05 считалось значимым. Значимые связи между работоспособностью и параметрами тонкой кишки в группах с массой тела при рождении оценивались с помощью ассоциативного анализа (процедура INSIGHT SAS). В таблицах и на рисунках данные представлены в виде среднего квадрата наименьших квадратов и объединенной SEM.

Этическое одобрение

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Федерального университета Минас-Жерайс (протокол № 2016/342).

Leave a Comment