Рекомбинантный анти-HER2 белок scFv-CCL19-IL7 ингибировал рост опухоли желудка in vivo

Все методы были выполнены в соответствии с соответствующими руководствами и правилами, и все экспериментальные протоколы были одобрены Медицинским университетом Хэбэй.

животные

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Хэбэйского медицинского университета, Хэбэй, Китай. Все эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Хэбэйского медицинского университета, Хэбэй, Китай. Все мыши NOD/SCID (диабетик без ожирения/тяжелый комбинированный иммунодефицит), использованные в этом исследовании, были здоровыми самцами (в возрасте 6–8 недель), которые были случайным образом распределены либо в экспериментальную, либо в контрольную группы.

Сотовые линии

HEK-293 T и клетки рака желудка человека NCI-N87 и SGC7901 были предоставлены Научно-исследовательским центром медицинского университета Хэбэй. Т-клетки HEK-293 культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (фетальная телячья сыворотка, Gibco, США), а клетки NCI-N87 и SGC7901 культивировали в среде RPMI-1640 (Gibco, США) с добавлением 10% ФБС. Все ячейки поддерживались при 37 ℃ в 5% CO.2.

здание вектор plvx-hic

Аминокислотная последовательность одноцепочечного варианта антитела против HER-2 (scFv) была такой, как описано ранее.18. Аминокислотные последовательности IL-7 человека и хемокин CCL19 человека были получены из GenBank. Экспрессионную конструкцию слитого белка HIC создавали путем слияния scFv против HER-2 с CCL19 и IL-7, и каждый элемент лигировали с линкером G34S.19 (рис. 1а). Эту конструкцию, содержащую сайт рестрикции XhoI/HindIII, полностью клонировали в pcDNA3.1, субклонировали в вектор pLVX-puro, содержащий кассету GFP, а затем использовали для получения упаковки лентивируса.

форма 1
форма 1

Схематическая диаграмма убивающих эффектов слитого белка HCI. (а) Иллюстративное представление конструкции слитого белка HCI. (Б) Схема убивающих эффектов слитого белка HCI при нацеливании на антиген-положительные опухолевые клетки HER-2. В отличие от эффектов ADCC, в основном индуцированных естественными клетками-киллерами, белок HCI может распознавать антиген HER-2 (функция HER-2 scFv), привлекать ДК и Т-клетки для инфильтрации участка опухоли (функция фрагмента CCL19) и активировать эффекторные клетки. (функциональность фрагмента CCL19) IL-7 и ДК, привлеченные HIC).

медленное производство вируса

Трансформацию лентивирусных векторов, экспрессирующих белок HIC, в Т-клетки оболочки HEK-293 проводили, как описано ранее.20. Вкратце, лентивирус получали путем коинфицирования Т-клеток HEK-293 пакетным вектором psPAX2, вектором оболочки pCL-VSVG и обоими векторами Lenti V2. Через 24 часа после трансфекции культуральную среду заменяли свежей DMEM с добавлением 10% FBS. Лентивирус собирали в супернатанте через 72 ч после трансфекции и использовали для переноса генов.

Экспрессия и очистка слитого белка HIC

Другую линию Т-клеток HEK-293 реанимировали в 6-луночных растениях и инфицировали вирусными супернатантами в присутствии полибреба (GeneChem, Китай) с последующей дополнительной 2-дневной инкубацией. Затем среду для выращивания DMEM заменяли на среду для селекции, содержащую 1 мкг/мл пуромицина, в течение 7 дней. Затем клетки размножали и замораживали после нормального роста клеток в выбранной среде для получения Т-клеток HEK-293, стабильно экспрессирующих слитый белок HCI (HCI-293 T).

Затем образцы белка очищали от лизатов Т-клеток HCl-293 с помощью колонки для ионообменной хроматографии (HiTrap™ DEAE FF; загрузочный буфер: Tris-HCl 0,02 моль/л, pH 8,8; и элюирующий буфер: 50 мМ/100 мМ). /200 мМ/500 мМ Tris-HCl NaCl 0,02 моль/л, pH 8,8; GE Healthcare Life Sciences, Чалфонт, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа BCA (Solarbio, Китай).

Вестерн-блот анализ слитого белка HIC.

Общий белок в Т-клетках HCI-293, экстрагированных лизисным буфером RIPA, содержащим ингибитор протеазы. Концентрацию белка определяли методом БСА (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Белки разделяли на 12% геле SDS-PAGE и переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF). Мембрану PVDF блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 2 ч, а затем инкубировали с первичными антителами при 4°C в течение ночи. После промывки ПВДФ-мембраны ее инкубировали с соответствующим вторичным антителом в течение 2 ч при комнатной температуре. Белки визуализировали на гель-имиджере с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal TM West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific, США). Использовали следующие первичные антитела: анти-His-метку (1:1000, Abcam) и анти-β-актин (1:2000, Abcam).

Получение клеток РВМС человека

Образцы периферической крови были получены от здоровых доноров в Хэбэйском центре крови, Хэбэй, Китай. Информированное согласие было получено от всех доноров в соответствии с рекомендациями, одобренными Хэбэйским медицинским университетом, Хэбэй, Китай. РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли из образцов цельной крови методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque (GE Healthcare, США). PBMC собирали из интерфазы, трижды промывали полной средой и затем культивировали в полной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS при 37°С с 5% CO.2 С ночевкой.

Анализ проточной цитометрии

Для анализа методом проточной цитометрии использовали BD FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) Aria II (BD Bioscience). Белок HER-2, экспрессируемый в клетках NCI-N87 и SGC7901, выявляли с помощью меченого FITC мышиного антитела к HER2 lgG1 (Santa Cruz, США); Гомозиготную контрольную группу окрашивали FITC-меченым lgG1 (Santa Cruz, США).

Связывающая способность слитого белка HCI с HER-2-позитивными опухолевыми клетками определялась как: 1 × 106 Клетки NCI-N87 или SGC7901 собирали, помещали в пробирку на 2 мл и промывали 3 раза 3 мл охлажденного льдом PBS, содержащего 4% BSA (бычий сывороточный альбумин). После промывки клетки суспендировали в 200 мкл охлажденного льдом промывочного буфера и инкубировали с 1 мкг слитого белка HIC при 4°С в течение 45 мин. Клетки промывали 3 мл ледяного промывочного буфера 3 раза, а затем инкубировали в темноте с 10 мкл РЕ-меченого бета-моноклонального антитела MIP-3 (Thermo Fisher Scientific, США) при 4°С в течение 30 мин. После двух дополнительных промывок клетки проверяли на наличие CCL19 на клеточной поверхности с помощью FACS. Для оценки иммунной системы человека у мышей NOD/SCID CD45-положительный фенотип памяти, связанный с РВМС, был обнаружен в венах мышей с человеческими CD3-FITC, CD19-APC-A, CD56-PE-A, CD33-PE-A ( оба BD Bioscience). Все операции выполняли в соответствии с инструкциями производителя, а данные FACS анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo 8.1.1 (FlowJo, LLC).

Анализ цитотоксичности

5 х 104 Клетки NCI-N87 или SGC7901 высевали в 100 мкл полной среды/лунку RPMI в 96-луночном плоскодонном планшете, соответственно, группа нормального физиологического раствора (группа NS) 10 мкл физиологического раствора, 10 мкл группы трастузумаба добавляли 1 мкг/лунку. мкл трастузумаба, набора слитых белков HCI добавляли к 10 мкл 1,5 мкг/мкл слитого белка HCI, затем добавляли клетки РВМС по мере увеличения отношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T = 5:1, 10:1, 20: 1) Лизис клеток-мишеней анализировали с помощью набора Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Япония) в соответствии с инструкциями производителя.

Элиза

ELISA проводили с той же процедурой, что и анализ цитотоксичности, за исключением того, что соотношение E: T было зафиксировано на уровне 20: 1. Через 24 часа мы собрали супернатанты, а затем измерили уровни высвобождения цитокинов IL-2 и IFN-γ с помощью ELISA. наборы (eBioscience, США).Американские). Для эксперимента in vivo мы собрали 100 мкл периферической крови мышей с ксенотрансплантатами, когда мышей умерщвляли.

Реконструкция гуманизированной иммунной системы у мышей NOD/SCID, борьба с онкогенезом и его лечение

Для реконструкции гуманизированной иммунной системы у мышей NOD/SCID (диабет без ожирения/тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышам вводили 4 × 107 РВМС в течение 4 недель, как описано ранее.21 Все методы описаны в соответствии с Руководством по доступу (https://arriveguidelines.org) для экспериментов на животных. Четыре недели спустя мышам NOD/SCID с иммунной системой человека подкожно инокулировали 5 × 106 Клетки NCI-N87/0,5 мл PBS для разработки ксенотрансплантата опухоли.

Примерно через 7 дней, когда размер опухоли достиг 150 мм3мышей случайным образом разделили на три группы, и этим трем группам вводили начальную нагрузочную дозу: группа NS: 0,5 мл/мышь, группа трастузумаба: 4 мг/кг/0,5 мл/мышь, группа HCI Fusion Protein: 5 мг/кг/мышь. 0,5 мл/мышь Мышь. Поддерживающие дозы определяли следующим образом: группа NS: 0,5 мл/мышь, группа трастузумаба: 2 мг/кг/0,5 мл/мышь и группа слитого белка HCI: 2,5 мг/кг/0,5 мл/мышь. Лечение повторяли один раз в неделю, объем опухоли измеряли штангенциркулем каждые два дня, и объем опухоли рассчитывали как объем = (длина х ширина)2)/2.Мышей умерщвляли через 4 недели после начальной обработки. Для определения секреции IFN-γ и IL-2 в сыворотке мыши использовали ИФА (eBioscience, США).

Гистопатологические исследования и иммунофлуоресценция

Для изучения патологии и клеточной инфильтрации проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммунофлюоресцентное окрашивание. Парафиновые срезы предварительно депарафинизировали и окрашивали гематоксилином. Затем срезы обезвоживали градиентом этанола и окрашивали эозином. Наконец, срезы закрывали, наблюдали и фотографировали под световым микроскопом (Токио, Япония, Nikon). Для иммунофлуоресцентного окрашивания парафиновые срезы депарафинизировали и помещали в буфер для извлечения антигена (pH 8,0). К срезам добавляли AutoFluo Quencher и инкубировали с BSA в течение 30 минут для блокирования сыворотки. К срезам по каплям добавляли первичное антитело и инкубировали при 4°С в течение ночи. Срезы промывали PBS (рН 7,4) и затем инкубировали со вторичными антителами в течение 50 мин. Срезы инкубировали с 4′,6-дифенил-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 10 минут для повторного окрашивания ядер клеток. Осматривали срезы и получали изображения под флуоресцентным микроскопом (Токио, Япония, Nikon). Использовали следующие первичные антитела: анти-DEC205 (1:1000, Abcam) и анти-CD3 (1:200, Abcam), и эти эксперименты независимо повторяли три раза.

статистический анализ

Все результаты выражены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего). Статистическую значимость оценивали с помощью ANOVA (односторонний дисперсионный анализ). Ценности с<0,05 считалось статистически значимым.

Leave a Comment