Иммунотерапевтические эффекты рекомбинантного антигена колоректального рака, продуцируемого в плодах томата

вектор экспрессии растений

Ампутированная форма антигена колоректального рака человека GA733-2 (AA 17-266)41,56,57 В этом исследовании использовали Fc-фрагмент человеческого IgG1 (Val97-Gly328, регистрационный номер GenBank AY172957). GA733-2, слитый с сигнальным пептидом Fc и ER человека (rGA733-Fc), амплифицировали с использованием праймеров GA733-Fsal (5′-ACGTCGAACATGGATACGGCG-3′) и Ig-Fsal (5′-ACGTCGACGTGAGCCCAAATCTTG-3)-Rsnab (5′ -).TGTACGTATCAGTTTCATCTTT-3′). Продукты ПЦР вводили в растительный вектор экспрессии pBINPLUS через сайты ферментов рестрикции SalI и SacI. Окончательные конструкции называются pBINPLUS-GA733-Fc и pBINPLUS-h-Fc.41 Его использовали для переворачивания помидоров.

Трансформация, опосредованная агробактериями Solanum lycopersicum Биография \ Резюме. Микро Том

семена диких помидоровSolanum lycopersicum Биография \ Резюме. Micro-Tom) Сангёп Ли из Седжонского университета в Республике Корея (РК). Растения томата WT и трансгенные линии выращивали в контролируемых условиях выращивания в помещении с циклом темноты 16 ч/8 ч (22–24 °C). Сбор растительного материала должен соответствовать соответствующим институциональным, национальным и международным нормам и законодательству. Этот эксперимент был проведен с разрешения Национального университета Чоннам (35°10 с.ш., 126°53 в.д.) в Кванджу, Республика Корея. Растительный материал и остатки были утилизированы в соответствии с рекомендациями по биобезопасности. Трансгенные растения томата, экспрессирующие rGA733-Fc или h-Fc, были получены с использованием Агробактерииопосредованный метод преобразования58. Семядоли трехнедельных стерильных растений томата разрезали на две части и инокулировали Agrobacterium tumefaciens раствор бактерий. После инокуляции экспланты помещали на среду совместного культивирования. [3% sucrose (Duchefa, RV Haarlem, Netherlands), 4.4 g/L MS salt (Duchefa, RV Haarlem, Netherlands), 0.1 mg/L IAA (Duchefa, RV Haarlem, Netherlands), 1 mg/L zeatin (Duchefa, RV Haarlem, Netherlands), and 200 μM acetosyringone (MBcell, Seoul, Korea), pH 5.2]. После двух дней совместного культивирования кусочки семядолей переносили на индукционную среду растения. [3% sucrose, 4.4 g/L MS salt, 50 mg/L kanamycin (Biosesang, Sungnam, Korea), 0.1 mg/L IAA, 1 mg/L zeatin, and 250 mg/L cefotaxime (Biosesang, Sungnam, Korea), pH 6.0], а вырезанные растения переносили на среду для индукции растений каждые 2-3 недели до появления регенерированного побега. Затем регенерированные побеги переносили в среду для удлинения (1,5% сахарозы, 4,4 г/л соли MS, 50 мг/л канамицина и 250 мг/л цефотаксима, pH 6,0) для дальнейшего развития. Затем хорошо развитый каллюс переносили в среду для индукции корней. [1.5% sucrose, 4.4 g/L MS salt, 50 mg/L kanamycin, 2 mg/L IBA (Duchefa, RV Haarlem, Netherlands), and 50 mg/L cefotaxime, pH 6.0]; Регенерированные семядоли переносили с корнями в почву и выращивали в ростовой камере (цикл 16 ч свет/8 ч темнота, 22–24 °С).

Экстракция геномной ДНК и ПЦР-анализ трансгенных растений

Геномную ДНК выделяли из 300 мг листьев трансгенных томатов для подтверждения введения трансгенной кассеты. Листья трансгенных томатов измельчали ​​до мелкого порошка жидким азотом и тщательно смешивали с 700 мкл раствора для экстракции ДНК. [0.05 M Tris–HCl, pH 7.6 (Biosesang, Sungnam, Korea), 0.5% SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.1 M NaCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.05 M EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), and 0.1 M β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)]. Смеси инкубировали при 50°С в течение 10 минут с переворачиванием каждые 2 минуты. Экстракты тщательно смешивали с 500 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1, Biosesang, Sungnam, Korea). Образцы центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 мин, затем верхнюю водную фазу переносили в свежие микроцентрифужные пробирки. В пробирки добавляли два объема 100% этанола и образцы перемешивали, осторожно переворачивая. Пробирки центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадки растворяли в дистиллированной воде после промывки 75% этанолом. Присутствие rGA733-Fc или кассеты экспрессии Fc человека в растениях определяли с помощью ПЦР-анализа с использованием праймеров 35S-F (5′-GGATGACGCACAATCCCACTATCC-3′), Fc-R (5′-AGGGAGGCTCTTCTGCGT-3). Реакции ПЦР проводили при следующих условиях; Предварительный прогрев при 95°С в течение 5 мин, 34 цикла амплификации (95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин), заключительная инкубация при 72°С в течение 10 мин.

rGA733-Fc, очистка белка

Трансгенные растения, содержащие кассету экспрессии rGA733-Fc, заземляли в буфере 0,5×PBS (8,17 мМ Na).2ГПО41,34 мМ KCl, 0,47 мМ K3с4, 68,45 мМ NaCl, рН 7,4). Растворимую фракцию промывали буфером для связывания (10 мМ NaH2PO4, 150 мМ NaCl, рН 8,2). После промывки общие растворимые белки очищали с помощью Affi-Gel.® Колонка с гелем протеина А (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) при скорости потока 0,5 мл/мин. Характер гликозилирования очищенных белков rGA733-Fc анализировали с помощью масс-спектрометрии (МС)/лазерной ионизации (MALDI-TOF) с использованием матрицы.

Вестерн-блот-анализ и количественная оценка белков rGA733-Fc и Fc человека в трансгенных растениях.

Суммарные растворимые белки выделяли из 200 мг листьев томатов. Собранные листья томатов гомогенизировали с помощью TissueLyser II (Qiagen, Калифорния, США) с одним объемом буфера Брэдли.59 при 30 Гц в течение 5 минут. 50 мкг общих растворимых белков разделяли на 10% или 12% SDS-полиакриламидном геле и переносили на поливинилиденфторидную мембрану (PVDF; GE Healthcare, США). Мембрану PVDF инкубировали с блокирующим раствором. [1% bovine serum albumin (BSA) and 5% skim milk] при 25°С в течение 3 ч, а затем промывали TBS-T (150 мМ NaCl, 2,5 мМ NaCl, 25 мМ трис-основы, 0,1% твин-20, рН 7,4). Специфицированный корпус кролика rGA733-257 Его использовали в качестве первичного антитела (разведение 1:5000), а козий IgG, конъюгированный с HRP, использовали в качестве вторичного антитела (разведение 1:5000, Thermo Scientific, Waltham, USA). Белки rGA733-Fc визуализировали с использованием системы Immobilon Western Chemiluminescence HRP (Millipore, Billerica, MA, USA) и анализатора люминесцентных изображений LAS-3000 (Fujifilm, Токио, Япония).

Количественное определение белка rGA733-Fc проводили, как описано ранее.41. 10 мкг/мл общих растворимых белков из листьев и плодов трансгенных томатов высевали на 96-луночный планшет для иммунизации. Отдельные лунки блокировали 200 мкл 5% обезжиренного молока в буфере PBS (16,34 мМ Na2HPO4, 2,68 мМ KCl, 0,94 мМ K3PO4, 136,9 мМ NaCl, pH 7,4) в течение 2 часов. Затем иммунный планшет инкубировали с разбавленным 1:2000 кроличьим антителом против rGA733-2, а затем инкубировали с разбавленным 1:2000 конъюгированным козьим антителом против человеческого IgG (Thermo Scientific, Waltham, USA). Концентрацию иммунопреципитированных белков определяли с использованием п-нитрофенилфосфата (1 мг/мл; Sigma-Aldrich, Сент-Калифорния, США).

анализ N-гликанов

Образцы расщепляли до гликопептидов пепсином с последующей обработкой пептидом N-гликозидазой (PNGase) A (Roche, Базель, Швейцария), как описано ранее.60. Высвобожденные N-гликаны очищали с использованием графит-углеродной смолы от Carbograph (Alltech, Lexington, MA). Очищенные гликаны высушивали, а затем повторно растворяли в смеси 90 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 2,7 мкл воды и 35 мкл йодметана для твердофазного перметилирования с использованием метода центрифужной колонки.61. Следуя ранее описанному процессу, слой хлороформа, содержащий перметилгликаны, сушили и ресуспендировали в 4 мкл 50%-ного раствора метанола. Затем его смешивали в равных объемах с матриксной 2,5-дигидроксибензойной кислотой, приготовленной в 1 мМ растворе ацетата натрия, для раствора масс-ионизации с помощью матричного лазерного поглощения (MALDI-TOF). Полученные смеси наносили на полированную пластину из стали MALDI MSP 96 (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия) и сушили. Масс-спектрометрию проводили в режиме положительных отражающих ионов с использованием Microflex (Bruker Daltonik). Все масс-спектры получены при ускоряющем напряжении 20 кВ по методике, рекомендованной производителем. Составы гликанов определяли из наблюдаемых масс с использованием программы поиска молекулярной массы гликанов на веб-сайте Консорциума функциональной гликомики (http://www.functionalglycomics.org/). Большинство возможных структур гликанов было предоставлено на основе коллективной информации N-гликанов растений.62.

Иммунизация мышей и индукция колоректального рака

Потенциальные противораковые эффекты rGA733-Fc были проверены на мышиной модели колоректального рака с трансгенными плодами томата. Семинедельных самцов мышей C57BL/6 приобретали у Damol Animal Breeding Company (Тэджон, Корея). Три мыши C57BL/6 в каждом состоянии иммунизировались каждые 2 дня в течение 4 недель 100 мг трансгенного экстракта плодов томата (RGA733-FCбык № 16 и H-FCбык №12) в 100 мкл PBS путем пероральной инъекции. Через четырнадцать дней мышам подкожно вводили 1×10 .6 клеток МС38. Начиная с 5-го дня после инъекции клеток МС38 измеряли объем опухоли в течение 13 дней. В конце эксперимента (D28) мышей подвергали эвтаназии. Общий IgA и IgG экстрагировали из фекалий и сыворотки, соответственно, и количественно определяли с помощью ELISA. Эксперимент проводился с использованием мышей в соответствии с рекомендациями Комитета по институциональному уходу за животными Чунамского национального университета и был одобрен Комитетом по этике Чунамского национального университета (CNU IACUC-YB-2013-07). Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE.

ПЦР-анализ в реальном времени

Суммарную РНК выделяли из опухолевых тканей с использованием реагента TRIzol (MRC, Цинциннати, Огайо, США) в соответствии с инструкциями производителя. 1 мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с помощью QuantiTect.® Набор для обратной транскрипции (Qiagen, Калифорния, США) и количественный анализ ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) выполняли с использованием QuantiTect.® СИБР® Зеленый набор для ПЦР (Qiagen, Калифорния, США) и триггер для амплификации в реальном времени Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Калифорния, США). Праймеры, используемые в этом исследовании, были приобретены у Cosmo Genetech (Сеул, Корея), и последовательности праймеров следующие: β-актин (прямой, 5′-GACGGCCAGGTCATCACTAT-3′ и обратный, 5′-AGTCCGCCTAGAAGCACTTG-3′), p53 (прямой, 5′-CATCACCTCACTGCATGGAC-3 и обратный, 5′-CTCGGGTGCTCATAAGGTA-3′), p21 (прямой, 5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3 и обратный, 5′-GCTCAGACACCAGTGCAA-3, 5′-ACCAGCTGAACAGATCATG-3 и обратный, 5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3 и обратная, 5′-GCTCACACACAGTGCAA-3, 5′-ACCAGCTGAACAGATCATG-3AGACTGCCTTG и обратная, 5”), buck (передняя, ​​5′-ACGAACTCTTCACCAAGATCCGCCT-3 и обратная, 5′-TCAAACCACGCTGGTAGACGTACA-3CTAc- 3′ и обратный, 5′-CACTGTCACACTGTCACTCCTAC-3′), ccl17 (прямой, 5′-CAGGAGAGCT-3′ и обратный, 5′-CACTGTCACACTGTCACTCCTAC-3′), ccl17 (прямой, 5′-CAGGAGAGCT-3′ TTGGGTATA – TTGTGTTCGCCTGTAGTGCATA-3), ccl21 (прямой, 5GAGCAAG-3) обратный, 5′-GTTGAAGCAGGGCAAGGGT-3′). β-актин использовали в качестве внутреннего контроля для нормализации, а относительную экспрессию рассчитывали методом ΔΔCt.

статистический анализ

Экспериментальные результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) и проанализированы с использованием непарного студента. р Протестировано GraphPad Prism (версия 8.4.2, GraphPad Prism Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Данные считались статистически значимыми *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.

Leave a Comment