Разработка фильтрующего устройства для профилактики водных бактериальных заболеваний с использованием конъюгата одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и конъюгата шелка.

Подготовка к А. сальмоницида

нетипичный А. сальмоницида (как таковой) (штамм B10F21, T1031) на чашках с агаром для инфузий сердца (HI; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Токио, Япония) в течение 72 ч при 20 °C. Колонии идентифицируются как как таковой Использование проточной цитометрии (FCM) с использованиемА. сальмоницида (противоположный-как таковойМоноклональное антитело (MAb)17. Отобранные колонии культивировали в 500 мл HI-бульона в течение 72 ч при 20°C. Концентрацию бактерий оценивали путем измерения поглощения при 600 нм или КОЕ. Инактивацию бактерий формалином проводили, как описано ранее. В качестве антигенов в следующих экспериментах использовали живые и убитые формалином бактерии.

Размножение и строительствоА. сальмоницида scFvs

Гибридомные клоны продуцируют MAb против как таковой4a и 8h, как описано ранее17. Тотальную РНК из гибридомных клеток подвергали обратной транскрипции с использованием набора для амплификации SMART™ RACE (Clontech, Mountain View, CA). ПЦР амплифицируют фрагменты (кДНК) областей VH и VL с соответствующими праймерами, затем смешивают и собирают в одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)22,23 путем четырехэтапной амплификации ПЦР с использованием соответствующих праймеров, содержащих линкерные последовательности (дополнительная фигура S1 и таблица S1). Полученные фракции переваривают нетЯ/победитьI и клонировали в вектор экспрессии pCAGGS-MCS.24,25. Тег Myc (EQKLISEEDL) вставлен в файл победитья/ префикс означает средуСайт RI для всех pCAG/анти-как таковой scFv строит. В результате каждый анти-как таковой-scFv были слиты с меткой Myc на С-конце.Номера доступа GenBank/EMBL/DDBJ для V-кодирующих последовательностей кДНКчас и В. Она 4А-Вчас, LC225752; 4А-В, LC225755; 8H-Vчас, LC225753; 8H-VLC225756.

Клетки и электропорация

мышиная гибридома T-клетки DO-11.1026 и гибридомные клетки, полученныекак таковой Антитела поддерживали в среде RPMI1640 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ MgCl. -Глютамин, 10 мМ HEPES (все от Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) и 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки DO-11.10 модифицировали до концентрации 5 × 106 400 мкл клеток/культуральной среды подвергали электрофорезу с 1,25% диметилсульфоксидом на кювету с использованием Gene Pulser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) с 20 мкг плазмидной ДНК при 290 В и 960 мкФ.

Конструирование плазмид для генетически модифицированных тутовых шелкопрядов

Фрагмент (кДНК) для анти-как таковой-scFv-Myc был получен с помощью ПЦР из pCAG/анти-как таковой-8H-scFv-Myc с использованием смыслового праймера № 13 и обратного праймера № 14 (дополнительная таблица S1). Продукт ПЦР расщепляли бацДобро пожаловать-спросилI, встроенный между областью промотора FibL через кодирующую область FibL (FibLpro-FibL) и 3′-нетранслируемую область FibL (FibL-3′-UTR), интегрированный фрагмент ДНК FibLpro-FibL-анти-как таковой -scFv-FibL-3′-UTR клонирован в файл прогрессивныйЯ-Fseя pBac[3XP3-mKOafm] Вектор, в котором последовательность ДНК DsRed2 заменена на исходный вектор, pBac[3XP3-DsRed2afm]27с моно Cosabira Orange (mKO)28 в качестве галочки. В этой сборке установлен pBac[3XP3-mKOafm]-LC-Счетчик- как таковой-scFv-Myc.

Создание генетически модифицированного тутового шелкопряда

Трансгенные шелкопряды были созданы, как описано в другом месте.2 С небольшими изменениями. Мутированная плазмида и вспомогательный плазмидный вектор pHA3PIG для кодирования ПиггиБак передавать18 Их смешивали в концентрации 0,2 мкг/мкл в 5 мМ фосфатном буфере и 0,5 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) и вводили в оплодотворенные яйца шелкопрядов W/cs1 через 5–10 ч после откладки яиц. Вылупившихся личинок (G0) выращивали на искусственной диете (Нихон Носан, Канагава, Япония) при 25 °C до тех пор, пока они не превратились в бабочек и не получили возможность спариваться. С помощью флуоресцентной микроскопии (MZ16FA, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) эмбрионы G1 трансгенных особей с экспрессией mKO исследовали через 6–7 дней после откладки яиц. Трансгенных тутовых шелкопрядов разводили и скрещивали между братьями и сестрами на протяжении как минимум трех поколений. Экспериментальный штамм WS19 нес трансген, кодирующий FibL, слитый с антигеном.как таковой-8H-scFv-Myc. Контрольный штамм S01 нес трансген, кодирующий FibL, в сочетании с анти-WASP scFv-Myc.10.

Растворение шелковых коконов и приготовление раствора шелка

Триста миллиграммов чешуи кокона (2-3 оболочки) разрезали на квадраты 2-3 мм, промывали в 5 мл 70% этанола, а затем растворяли в 3 мл 9 мл LiBr и 90 мМ трис-HCl (№ рН 9,0). . Квадраты кокона подвешивали на четыре часа при 37°С до полного растворения белков шелка. Растворенные растворы шелка модифицировали до концентрации 10 мг/мл в 2 М LiBr в качестве маточного раствора.

иммунный

Клетки DO-11.10, трансфицированные растворами альгината и шелка из штаммов W/cs1, S01 и WS19, обрабатывали 2× буфером для образцов SDS, разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Bio-Rad). Блоты блокировали с помощью Blocking One (Nacalai Tesque, Киото, Япония) в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с поликлональными антителами против Myc (MBL, код № 562, Нагоя, Япония), антителами к β-актину кролика (MAb) ( Cell Signaling Technology, Code No. 4970, Дэнверс, Массачусетс, США), поликлональное антитело против FibL (выработанное против синтетического пептида, представляющего остатки FibL 67-80), а затем иммуноглобулин, конъюгированный со щелочной фосфатазой (Igs) (Dako) D0306 , Глоструп, Дания). Иммунофлуоресцентные белки выявляли с использованием набора растворов BCIP-NBT для красителя щелочной фосфатазы (Nacalai Tesque).

Элиза

Трансфицированные геном клетки DO-11.10 лизировали буфером RIPA (50 мМ Tris-HCL, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% дезоксихолат натрия и смесь ингибиторов протеаз; Nacalai Tesque) на льду в течение 1 часа. . . . Клеточные лизаты центрифугировали при 10000×. грамм в течение десяти минут при 4°С и супернатанты использовали для ELISA. Исходные растворы шелка (10 мг/мл в 2 М LiBr) разбавляли 1 мМ Трис-HCl (рН 8,0) до концентрации 0,2 мг/мл. Сто мкл клеточного раствора, культуральный супернатант клеток гибридомы и разбавленный раствор шелка наносили на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки PBS каждую лунку блокировали разбавителем ELISA (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) при комнатной температуре в течение 1 часа. После пяти промывок PBS и Tween 20 формалин инактивировался.как таковой (1,8 х 108 КОЕ/мл разводили, раскладывали по лункам и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин. Корреляцию выявляли при последовательной инкубации чашек с . как таковой-4A MAb и HRP, конъюгированные с IgG Fc мыши (abcam, ab97265), с последующей инкубацией с раствором субстрата TMB для ELISA POD (Nacalai Tesque). После появления окраски реакцию с 2N H останавливали.2Так4, Поглощение измеряли при 450 нм с помощью устройства для чтения микропланшетов (iMark™ Microplate Reader; Bio-Rad).

Анализ фильтрации с использованием стеклянной ваты с шелковым покрытием

1 грамм стекловаты (Masuda Corporation, Осака, Япония) замачивали в растворе с 4 мл 0,2 мг/мл WS19, W/cs1, S01 или без него в 1 мМ трис-HCl (pH 8,0) и инкубировали при 4 мл . С ночевкой. После инкубации стекловату вынимают и промывают чистой стерильной водой. Затем эту стекловату упаковывали в коммерческий воздушный фильтр для воды (Suisaku Octa-Core Mini; Suisaku Co., Ltd., Япония) (рис. 3а). 4,9 х 107/мл хватает на жизнькак таковой суспендировали в 1,68 л дистиллированной воды и поровну разделили на 12 чашек (140 мл/стакан). В каждый стакан вставляли фильтрующие элементы и собирали отфильтрованные бактериальные растворы через 0, 1, 3, 10, 30 мин, 1, 2 ч после начала аэрации. Мутность полученных образцов измеряли с помощью спектрофотометра при 600 нм. Изображения отфильтрованной воды также были получены через 0, 10, 30 мин, 1 и 4 ч фильтрации. Адсорбция конвергентного шелка на шерсти была подтверждена вестерн-блоттингом с анти-Myc-tag-pAb в качестве первичного антитела и анти-IgG (H + L-цепь) (кроличьего) pAb-HRP в качестве вторичного (MBL Life Sciences) (Данные ) не показано).

Стеклянную вату вынимали в блоки фильтров, тщательно промывали 100 мл дистиллированной воды в химическом стакане и обрабатывали 2 мл 0,01% Triton X 100-PBS в течение десяти минут. Ремувер получали после центрифугирования, разбавляли в 10 раз карбонатно-бикарбонатным буферным раствором и подвергали непрямому ИФА. противоположный- как таковой В качестве первичных и вторичных антител использовали MAb 5H (разведение 1:5000 при асците крыс) и антитела IgG Fc-HRP Fc (MBL life science, Япония) в разведении 1:50000 соответственно. Дальнейшие этапы этого ELISA следовали, как описано выше. Эти эксперименты были повторены независимо трижды.

статистический анализ

Пары образцов анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Множественные образцы оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с критерием Тьюки. Различия считались значимыми, когдас< 0,05.

Leave a Comment